0 引言 Introduction

骨肉瘤是一种常发生于青少年并且生长在膝关节周围的恶性肿瘤[1]。据相关统计，全世界骨肉瘤的发病率正在逐渐增加[2]。骨肉瘤的常见并发症是肺转移和病理性骨折，转移性骨肉瘤患者其病情会进一步加重[3]，其典型的临床症状包括疼痛、关节活动受限和局部肿胀。虽然患者经相关治疗后生命得到一定的延长，但最终身心健康却受到严重的影响[4]。骨肉瘤的发生发展是多因素多阶段累积作用的结果，包括环境因素、遗传因素等[5]。因此，研究骨肉瘤的发病机制并且优化治疗策略是非常迫切和必要的。

miRNA是一种非常小的RNA分子，通过直接作用于mRNA的3'-UTR来抑制其表达[6]。据报道，miRNA即可作为一种致癌因子也可作为一种抑癌因子[7]，miRNA可以调控癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡等生物学活动[8]。研究发现，miR-603通过靶向BRCC2促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭[9]，miR-130b通过靶向NKD2促进骨肉瘤细胞的发生与发展[10]。有关miR-1307在肿瘤中的作用已有多篇报道，例如miR-1307通过靶向FOXO3A促进前列腺癌细胞的增殖[11]，并且过表达miR-1307可抑制p27和p21的水平。除此之外，miR-1307也可以通过靶向SMYD4促进乳腺癌的生长，miR-1307在早期乳腺肿瘤组织中显著升高，过表达miR-1307还可显著促进裸鼠非致瘤性乳腺上皮细胞的增殖、转化和肿瘤形成，沉默miR-1307表达不仅可以抑制裸鼠乳腺癌细胞的增殖，还可以延缓乳腺癌细胞的成瘤时间[12]。临床研究发现，miR-1307、miR-6861-5p、miR-4634、miR-1246和miR-6875-5p几种miRNA的组合可以用于检测早期乳腺癌，其检测准确率高达89.7%[13]。miR-1307通过靶向ING5促进卵巢癌细胞的增殖并抑制凋亡，研究还表明miR-1307在卵巢癌细胞系A2780/Taxol中过表达，miR-1307的过表达或缺失可以促进或抑制化疗耐药的作用[14]。另外，研究发现miR-1307通过靶向DAB2促进肝细胞癌的转移和生长，与邻近的非肿瘤组织以及正常肝细胞系LO2相比，miR-1307在肝癌细胞中明显高表达，此外值得注意的是，高水平miR-1307提示患者的临床预后较差[15]。由此可见，miR-1307很可能为致癌miRNA，并且已将miR-1307用于早期乳腺癌的临床诊断和肝癌的临床预后判断，说明其具有潜在研究价值和临床应用前景，但是它在骨肉瘤中的作用及其基本的分子机制目前为止尚不清楚。

外泌体大小为30-150 nm，由细胞膜融合并分泌到细胞外的小颗粒[16]，其在细胞间相互联系中起着极其重要的作用，siRNA和miRNA可以通过它进行传递[17-18]。已有研究表明，肿瘤细胞来源外泌体可通过转移肿瘤细胞中对肿瘤生长有正向作用的小分子，进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及耐药性[19]。研究表明，骨肉瘤细胞来源外泌体在骨代谢方面的作用与一些特定的miRNAs相关，并证明这些外泌体参与了破骨细胞分化和骨吸收活性，此外U-2OS骨肉瘤细胞来源外泌体中miRNA-155-5p低表达和miRNA-375高表达[20]。骨肉瘤细胞来源外泌体促进了人脐静脉内皮细胞的侵袭性和刺激人脐静脉内皮细胞产生高水平的促血管生成因子，并通过成管实验证明了内皮细胞样结构的形成[20]，并且还发现正常对照组成骨细胞分泌的外泌体并不能刺激血管生成和破骨细胞生成。除此之外，研究发现癌相关成纤维细胞来源外泌体miR-1228通过直接靶向SCAI促进了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭[21]。骨肉瘤来源外泌体miR-675通过靶向CALN1促进hFOB 1.19成骨细胞的迁移和侵袭[22]。通过在间充质干细胞中转染miR-143然后提取外泌体作用于骨肉瘤细胞，发现间充质干细胞外泌体miR-143可以抑制骨肉瘤细胞的迁移[23]。但是，骨肉瘤细胞衍生的外泌体及外泌体内的miRNA对骨肉瘤细胞自身的影响到目前为止尚不清楚，因此仍需进一步研究。

该实验探讨骨肉瘤细胞来源外泌体对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响，进一步验证骨肉瘤细胞外泌体中的miR-1307是否通过靶向AGAP1调控骨肉瘤细胞的增殖和凋亡，从而为骨肉瘤的治疗及预后提供实验依据。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外水平进行分子生物学和细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2019年5月至2020年1月在石河子大学医学院骨科重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 细胞的选择 骨肉瘤细胞系(143B，MG63，U2OS，Saos-2，SW1353)和成骨细胞hFOB 1.19细胞系均购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.3.2 实验主要试剂 miR-1307-3p mimic、miR-NC mimic、miR-1307-3p inhibitor、 vector(锐博，中国)；Lipofectamine RNAiMAX、Trizol 裂解液(Invitrogen, 美 国)；无外泌体血清(SBI，美国)；青链霉素、PBS、胎牛血清及RPMI-1640培养基(Hyclone, 美国)；荧光素酶试剂盒、CCK-8检测试剂(Promega，美国)；胰蛋白酶消化液(Gibco，美国)；BCA蛋白含量检测试剂盒和细胞凋亡试剂盒(凯基，中国)；GAPDH优质内参(康成，中国)；兔抗AGAP1(Abcam，英国)；蛋白预染Marker(Thermo，美国)；RIPA裂解液(碧云天，中国)；反转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒(ABI，美国)；96孔板及6孔板(Corning，美国)。

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